2025年6月1日，貴州大學綠色農藥全國重點實驗室博士生楊玉嬡作為第一作者，宋寶安院士作為通訊作者，在國際知名學術期刊Journal of Advanced Research(中科院一區(qū)TOP，Impact Factor = 11.4，CiteScore = 21.6)上在線發(fā)表“Antiviral activity and mechanism of purine morpholine nucleoside analogues incorporating a sulfonamide fragment”為題的研究論文。團隊以嘧啶核苷和嘌呤核苷作為核心母體結構，通過引入磺胺基團作為藥效團，設計并高效合成了兩類新型核苷類衍生物：64個磺胺取代嘧啶核苷類衍生物和38個磺胺取代嘌呤核苷類衍生物，成功發(fā)現磺胺結構單元的嘌呤嗎啉核苷類小分子抑制劑C1。機制研究揭示了其通過靶向PMMoV CP 13位的酪氨酸殘基(Tyr13)，抑制I3QHX5(Adenosylhomocysteinase)與PMMoV CP之間形成的相分離，對凝聚體具有破壞作用，從而干擾了病毒粒子的形成，實現抗辣椒輕斑駁病毒的目的。研究獲得了國家基金重點項目(32330087)的支持。

　　辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottled virus, PMMoV)是一種RNA病毒，是辣椒作物中最具破壞性的病原體之一，由于其高傳染性和在土壤中穩(wěn)定存在，這種病毒作為水生環(huán)境和水處理系統中人類糞便污染的潛在病毒指示物越來越引起人們的關注。最新研究表明，PMMoV在糞便中的檢出率與宿主特異性免疫應答存在統計學關聯，揭示該病毒可能對人類健康具有潛在致病風險。鑒于PMMoV在污染種子、植物殘體、土壤及水體中表現出極強環(huán)境穩(wěn)定性，其對生態(tài)安全、食品安全及公共健康的潛在威脅正受到日益廣泛的關注。當前針對PMMoV的防控策略主要依賴抗病品種篩選，缺乏有效防治該病毒的藥劑。因此，基于天然產物設計，合成出一種高效、低毒、環(huán)境友好的抗病毒劑來抑制PMMoV并揭示其分子靶標具有重要的意義。

　　胞嘧啶核苷類藥物是對天然核苷(酸)的堿基或糖基部分進行修飾，或者同時對堿基和糖基進行雙重修飾，可得到核苷類似物或核苷酸類似物。近十多年來，嘧啶類核苷抗病毒藥物發(fā)展迅速，以胞嘧啶為中間體創(chuàng)新出抗病毒活性的化合物不計其數，它具有廣泛的抗病毒活性，如HIV，HCV，H5N5，HCMV，DENV等。同樣，在農業(yè)領域，胞嘧啶核苷類藥物類衍生物也展現出了抗病毒生物活性，嘧肽霉素和寧南霉素均成為抗病毒劑代表品種。然而，盡管核苷類藥物在農業(yè)領域具有巨大的應用潛力，但關于其抗植物病毒的創(chuàng)新研究卻仍然相對較少。

　　該研究聚焦于PMMoV，以醫(yī)藥及農藥領域具有廣泛生物活性的胞嘧啶核苷和嘌呤核苷為先導化合物，基于活性片段拼接策略，通過引入磺胺結構單元，設計并合成了2個系列含磺胺結構單元的胞嘧啶核苷類衍生物及1個系列含磺胺結構單元的嘌呤核苷類衍生物。即2-(乙酰氧基甲基)-6-(5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類衍生物(A)、2-(乙酰氧基甲基)-6-(8-取代-5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類衍生物(B)和2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-取代-6-嗎啉基-9H-嘌呤-9-基)-5-((取代苯基)磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類衍生物(C)。以寧南霉素為對照藥劑，采用半葉枯斑法，測試了含磺胺結構單元的胞嘧啶核苷類衍生物A1-A32、含磺胺取代的胞嘧啶核苷類衍生物B1-B32、含磺胺結構單元的嘌呤核苷類衍生物C1-C38對PMMoV的抑制活性，研究發(fā)現化合物C1對PMMoV表現優(yōu)異的抑制活性，其EC50值為37.0 μg/mL，優(yōu)于對照藥劑寧南霉素(68.9 μg/mL)。進一步研究發(fā)現，化合物C1與PMMoV CP具有優(yōu)異的結合力，其Kd值為1.50 μM，優(yōu)于對照藥劑寧南霉素(13.59 μM)。為了深入探究目標化合物抗PMMoV的作用機制，研究團隊以C1為模型化合物，通過在嘌呤環(huán)結構中引入炔基基團，成功合成小分子探針化合物C2?；钚詼y定結果表明，C2對PMMoV的抑制活性與C1相當，且均優(yōu)于對照藥劑寧南霉素，表明C2可作為小分子探針用于靶蛋白捕獲。通過ABPP、濃度依賴性及競爭性抑制實驗及MST分析，明確PMMoV CP為C1的直接作用靶標。進一步通過分子對接技術篩選C1作用在PMMoV CP上的關鍵作用位點，發(fā)現C1與PMMoV CP相互作用的關鍵氨基酸位點為13位和140位的酪氨酸(Tyr13、Tyr140)。為解析這兩個位點在病毒侵染過程中的功能，構建了pCB-GFP-PMMoV CP^Y13A和pCB-GFP-PMMoV CP^Y140A的侵染性克隆，通過Western blot和RT-qPCR技術，分別檢測其CP蛋白及CP基因在7、14及21 dpi時的表達水平。結果顯示，Tyr140突變?yōu)楸彼?Y140A)可延緩病毒的系統侵染進程，而Tyr13突變?yōu)楸彼?Y13A)則顯著抑制病毒的系統侵染，表明PMMoV CP第13位氨基酸的改變對病毒侵染過程具有決定性影響。基于上述關鍵發(fā)現，本研究擬通過Co-IP MS及RNA-seq，分析PMMoV CP野生型與Y13A突變體在互作蛋白層面的差異，以期闡明導致兩者侵染表型差異的分子機制。

圖1 C1靶向PMMoV CP 13位的酪氨酸殘基，抑制I3QHX5與PMMoV CP之間的相分離

　　基于RT-qPCR技術對Co-IP MS及RNA-seq篩選獲得的蛋白進行差異表達驗證，成功鑒定出5個候選蛋白(A0A248QEL2、B1PSM0、I3QHX5、LOC109221810、A2IBL2)。為解析PMMoV CP與PMMoV CP^Y13A在蛋白互作網絡中的差異，采用LCA及BiFC進行蛋白互作驗證。LCA結果表明，PMMoV CP與PMMoV CP^Y13A均能與上述5個候選蛋白發(fā)生互作；而BiFC分析表明，僅A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5可與PMMoV CP和PMMoV CP^Y13A形成特異性互作，而LOC109221810與A2IBL2未檢測到熒光信號。值得關注的是，盡管PMMoV CP和PMMoV CP^Y13A均能與A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5互作，但在與I3QHX5的互作過程中呈現顯著差異：PMMoV CP與I3QHX5互作時誘導形成大量生物分子凝聚體，而PMMoV CP^Y13A與I3QHX5互作則無凝聚體產生。通過融合-裂變動態(tài)觀察及FRAP技術分析，證實PMMoV CP與I3QHX5形成的凝聚體在體內外均具備LLPS特性，而PMMoV CP^Y13A喪失了誘導LLPS的能力，提示該凝聚體可能參與病毒侵染促進過程。進一步研究發(fā)現，在30、36及42 hpi添加小分子化合物C1，可顯著影響PMMoV CP，PMMoV CP^Y13A與I3QHX5的互作效率及凝聚體形成數量。Western blot及RT-qPCR檢測進一步證實，沉默I3QHX5導致PMMoV CP蛋白積累量及病毒RNA水平顯著降低，表明I3QHX5是病毒復制的正調控因子，PMMoV可通過調控該蛋白促進自身增殖。上述結果共同表明，C1發(fā)揮抗病毒活性的分子機制可能與抑制CP介導的LLPS凝聚體形成密切相關。該發(fā)現為解析病毒利用宿主相分離機制完成生命周期提供了新視角，并進一步支持靶向CP介導的LLPS作為抗病毒策略的合理性。

圖2 化合物C1抑制PMMoV復制的可能作用機制模式圖

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